Свой первый космический полёт Владимир Комаров совершил 12 октября — 13 октября 1964 года на борту космического корабля «Восход» вместе с космонавтами Константином Феоктистовым и Борисом Егоровым. Это был первый в мире многоместный космический корабль. Впервые в составе экипажа были не только лётчик, но также инженер и врач. Впервые в истории экипаж совершал полёт без скафандров. Впервые была применена система мягкой посадки. Позывной «Рубин» сутки звучал с орбиты. Итоговая длительность полёта составила 24 часа 17 минут, за это время корабль 16 раз облетел земной шар. Основной задачей полёта было обеспечение приоритета СССР в полётах в космос экипажа из нескольких космонавтов. За успешное выполнение полёта Владимиру Комарову было присвоено звание Героя Советского Союза, вручён орден Ленина и медаль «Золотая Звезда». Вскоре ему присвоили квалификацию «Космонавт 3-го класса», а 23 января 1965 года его назначили инструктором-космонавтом в группу космонавтов, готовившихся по программам Министерства обороны.

В сентябре 1965 года он был включён в группу подготовки к полёту по программе «Союз». В августе 1966 года было принято решение, что Владимир Комаров будет пилотировать «Союз-1». Его дублёром назначили Юрия Гагарина (вполне возможно, что будь жив Королёв, было бы наоборот, поскольку генеральный конструктор обещал Гагарину второй полёт на новом корабле). Этот полёт 23 апреля — 24 апреля 1967 года оказался роковым: Владимир Комаров погиб при завершении программы полёта, когда во время спуска на Землю не вышел основной парашют спускаемого аппарата. Стропы запасного парашюта скрутились из-за вращения спускаемого аппарата. На большой скорости спускаемый аппарат врезался в землю в пустынной местности в Адамовском районе Оренбургской области и загорелся. Аппарат был полностью разрушен при столкновении с землей и вследствие начавшегося после этого возгорания остатков конструкции.