Борис Кустодиев родился в Астрахани. Его отец был профессором философии, истории литературы и учил логике в местной духовной семинарии.
Отец умер, когда будущему художнику не было и двух лет. Учился Борис в церковноприходской школе, потом в гимназии. С 15 лет брал уроки рисования у выпускника Петербургской Академии художеств П. Власова.
В 1896 году поступает в Петербургскую Академию художеств. Обучался сначала в мастерской В. Е. Савинского, со второго курса — у И. Е. Репина. Принимал участие в работе над картиной Репина «Торжественное заседание Государственного совета 7 мая 1901 года» (1901–1903, Русский музей, Санкт-Петербург). Несмотря на то что молодой художник снискал широкую известность как портретист, для своей конкурсной работы Кустодиев выбирает жанровую тему («На базаре») и осенью 1900 года выезжает в поисках натуры в Костромскую губернию. Здесь Кустодиев знакомится со своей будущей женой Ю. Е. Порошинской. 31 октября 1903 года заканчивает учебный курс с золотой медалью и правом на годовую пенсионерскую поездку за границу и по России. Ещё до окончания курса принял участие в международных выставках в Петербурге и Мюнхене (большая золотая медаль Международной ассоциации).
В декабре 1903 года вместе с женой и сыном приезжает в Париж. Во время своей поездки Кустодиев побывал в Германии, Италии, Испании, изучал и копировал работы старых мастеров. Поступил в студию Рене Менара.
Через полгода Кустодиев возвращается в Россию и работает в Костромской губернии над сериями картин «Ярмарки» и «Деревенские праздники». В 1904 году становится членом-учредителем «Нового общества художников». В 1905–1907 гг. работал карикатуристом в сатирическом журнале «Жупел» (известный рисунок «Вступление. Москва»), после его закрытия — в журналах «Адская почта» и «Искры». С 1907 года — член Союза русских художников. В 1909 году по представлению Репина и других профессоров избран членом Академии художеств. В это же время Кустодиеву было предложено заменить Серова на посту преподавателя портретно-жанрового класса Московского училища живописи, ваяния и зодчества, но, опасаясь, что эта деятельность отнимет много времени от личной работы и не желая переезжать в Москву, Кустодиев отказался от должности. С 1910 года — член возобновившегося «Мира искусства».
1913 — преподавал в Новой художественной мастерской (Санкт-Петербург).
1923 — член Ассоциации художников революционной России.
В 1909 году у Кустодиева появились первые признаки опухоли спинного мозга. Несколько операций принесли лишь временное облегчение, последние 15 лет жизни художник был прикован к инвалидному креслу. В силу болезни работы он был вынужден писать лёжа. Однако именно в этот тяжёлый период жизни появляются его наиболее яркие, темпераментные, жизнерадостные произведения.
Послереволюционные годы прожил в Петрограде-Ленинграде. Был похоронен на Никольском кладбище Александро-Невской лавры. В 1948 году прах и памятник были перенесены на Тихвинское кладбище Александро-Невской лавры.